PENETAPAN SECARA KLINIS KADAR GLUKOSA DALAM SERUM MANUSIA DENGAN BIOSENSOR KULIT TOMAT

PENETAPAN SECARA KLINIS KADAR GLUKOSA DALAM SERUM MANUSIA

DENGAN BIOSENSOR KULIT TOMAT

A.      Latar Belakang

Penentuan yang cepat dan tepat kadar glukosa darah merupakan hal yang penting dalam tahap diagnose dan manajemen pengelolaan diabetes. Oleh karena itu, banyak sensor telah dikembangkan dan diperkenalkan untuk pemantauan glukosa darah.Penderita Diabetes Melitus di seluruh dunia menderita akibat kekurangan insulin, yang harus dikontrol dengan memantau glukosa darah dan menyuntikkan insulin sesuai dosis harian.

Beberapa tahun terakhir, berbagai membran telah dikembangkan dan diuji  untuk menjebak enzim, sehingga diharapkan aktivitas enzim stabil (baik) dan pasien untuk terapi gejala Diabetes Melitus memerlukan penilaian yang akurat terhadap level glukosa darah untuk tiap beberapa interval waktu.

Dalam penelitian ini, kulit tomat memiliki kemampuan yang baik dalam kesesuaiannya sebagai biosensor, dan sifatnya porinya yang dapat ditembus oleh udara dan air.Hal ini dapat dimanfaatkan sebagai media pergerakan enzim yang ideal dalam pembuatan biosensor berbasis enzim untuk menghasilkan biosensor sehingga  data yang diperoleh akurat dan respon yang cepat.

Pada umumnya digunakan tipe elektroda Clark untuk mendeteksi perubahan konsentrasi oksigen selama konversi enzimatik.Pada penelitian ini dapat digambarkan bahwa sistem analisis amperometri dimanfaatkan untuk penetapan kadar glukosa yang cepat dan akurat pada serum manusia menggunakan biosensor berdasarkan enzim glukosa oksidase yang dijebak pada media kulit tomat dengan elektroda oksigen terlarut.

B.      Dasar Teori

1.                   Enzim Glukosa Oksidase (GOD)

β-D-glukosa:oksigen 1-oxireduktase, EC 1.1.3.4 merupakan jenis flavoprotein yang mengkatalis reaksi oksidasi dari beta-D-glukosa oleh molekul oksigen. GOD dihasilkan dari  jamur Aspergillus Niger dan Penicillium yang bekerja spesifik mengkatalisis oksidasi β-glukosa.

Hasil oksidasi ini adalah glukonolakton dan hidrogen peroksida (H₂O₂). Pada tahap selanjutnya, senyawa glukonolakton ini akan dihidrolisis menjadi asam glukonat (Wang, 2008:2049). Secara garis besar, enzim ini akan menghasilkan hidrogen peroksida dalam setiap reaksi yang dijalankannya. Reaksi enzimatis glukosa oksidase digambarkan sebagai berikut :

Glukosa oksidase

 

Glukosa + O₂ + H₂O         -------------------->        O-glukono-δ-lakton + H₂O₂

H₂O₂-------------------->2H + O₂ +2 e⁻

               

Skema Reaksi enzim yang terjadi (Wang, 2008:2047)

               

2.       Immobilisasi Enzim

Reaksi enzimatis yang teramobilisasi telah terbukti sebagai teknik yang efisien dalam beberapa aplikasi.Suatu biokatalis dikatakan teramobilisasi jika mobilitasnya dibatasi dengan perlakuan fisika atau kimia.Menurut Susanto (2003), beberapa keuntungan yang diperoleh dari enzim yang teramobilisasi adalah

a.       Perolehan kembali enzim (enzyme recovery)

b.      Pemisahan enzim dari substrat dan produk lebih mudah

c.       Stabilitas enzim meningkat

d.      Biaya operasional lebih rendah

Imobilisasi enzim didasarkan pada lokalisasi enzim dalam kisi dari matriks polimer atau membrane. Hal ini dilakukan sedemikian rupa untuk mempertahankan aktivitas enzim dalam proses penetrasi substrat. Tahap desain dan preparasi merupakan kunci untuk membuat  sebuahbiosensor sehingga diharapkan enzim tetap berada dalam keadaan stabil dan mudah untuk bereaksi dengan substrat. Pilihan teknik penjebakan enzim sangat penting dalam hal stabilitas jangka panjang biosensor. Teknik yang dipilih harus sesuai dengan karakteristik dari enzim dan substrat yang digunakan. Teknik yang tidak sesuai akan dapat mengurangi aktivitas enzim dan menghasilkan respon sensor yang rendah (Aziz, 2006:15).

Beberapa teknik yang digunakan dalam penjebakan enzim adalah

a.       Penjebakan (Entrapment)

Penjebakan enzim didasarkan pada lokalisasi enzim dalam kisi dari matriks polimer atau membran. Hal ini dilakukan sedemikian rupa untuk mempertahankan aktivitas enzim dalam proses penetrasi substrat.

Gambar 1. Ilustrasi penjebakan enzim (Enzyme Entrapment) dalam kisi matriks.

Teknik penjebakan ini diaplikasikan pada sensor type clark, sehingga  ada hubungan yang erat antara enzim dan transduser, dan dapat memberikan stabilitas yang baik pada perubahan suhu, pH,  dan konsentrasi substrat.

b.      Adsorpsi

Teknik adsorpsi, enzim melekat pada permukaan  partikeldengan ikatan yang terjadi adalah vander Waals,ikatan ion, ikatan hidrogen dan daya  hidrofobik.

Gambar 2. Ilustrasi teknik adsorpsi dalam penjebakan enzim (Enzyme Entrapment).

Banyak zat/partikel dapat menyerap enzim pada permukaannya, namun perlu dilakukan suatu reaksi kimia maupun fisika pada permukaan tersebut sehingga dapat memaksimalkan proses penjebakan. Keuntungan yang diperoleh dari teknik adsorpsi ini adalah penggunaan reagen yang minimal dan waktu preparasi yang singkat. Namun, adsorpsi enzim rentan terhadap perubahan suhu, pH,  polaritas, dan konsentrasi substrat  sehingga enzim akan kehuilangan stabilitasnya (Aziz, 2006:17).

c.       Ikatan Kovalen

Ikatan kovalen langsung terbentuk antara enzim dan bahan pendukung. Ikatan kovalen merupakan ikatan kimia yang kuat sehingga mengakibatkan stabilitas enzim yang teramobilisasi menjadi lebih kuat. Akibatnya aktivitas enzim tetap terjaga walaupun terdapat gangguan seperti tingginya konsentrasi substrat atau gangguan dari larutan buffer dengan kapasitas ion besar. Namun, aktivitas enzim optimal tidak dapat dicapai bila proses penjebakan enzim tidak dilakukan dengan benar dibawah kondisi kontrol dari enzim yang digunakan (Ghous, 2001:2).

                                                                                                                                                                               

  Gambar 3. Ilustrasi teknik ikatan kovalen dalam penjebakan enzim (Enzyme Entrapment).

d.      Ikatan Silang

Teknik ikatan silang ini merupakan teknik penggabungan antara enzim yang satu dengan yang lain membentuk suatu struktur 3 dimensi. Reaksi ini dapat dilakukan dengan reagen pereaksi seperti gluteraldehyde, bis-diazobenzidine and asam 2,2-disulfonat.                     

Dalam teknik ikatan silang ini,enzim berikatan silang dengan glutaraldehid untuk membentuk suatu molekul terlarut, ikatan silang pada enzim  dapat terjadi setelahimpregnasi bahan pendukung berpori dengan larutan enzim.

Teknik ini dipilih sebagai metode yang tepat dalam menstabilkan aktivitas enzim. Reaksi ikatan silang yang terjadi dapat menyebabkan perubahan signifikan dalam situs aktif enzim, sehingga uji aktivitas harus dilakukan untuk memastikan bahwa situs aktiftetap bebas dan tersedia untuk aktivitas katalitik enzim (Aziz, 2006:19).

        Gambar 4. Ilustrasi teknik ikatan silang dalam penjebakan enzim (Enzyme Entrapment).

Reaksi antara enzim dengan pereaksi ikatan silang sebagai berikut :

3.       Biosensor

Biosensor adalah alat pendeteksi yang menggabungkan komponen biologis (mis.mikroba, jaringan, sel, bakteri, protein, enzim, antibodi) dan elektronis untuk menghasilkan sinyal yang terukur,yg dapat mendeteksi, mencatat, dan mengirimkan informasi secara cepat (Ekosari,  2010:1).

Perkembangan teknologi pengukuran gula darah sebagai berikut (Aziz, 2006:21):

Prototipe biosensor pertama adalah elektroda enzim yang dilaporkan pada tahun 1962,
memanfaatkan amobilisasi enzim GOD  pada elektroda pt O2 tipe  Clark untuk mengukur konsentrasi glukosa dalam larutan. Prototipe elektroda enzim ini  kemudian menjadi dasar  pengembangan elektroda enzim dalam analisis glukosa komersial pertama.

Biosensor yang baik setidaknya harus mengikuti beberapa persyaratan berikut (Aziz, 2006:10) :

1.       Biokatalis harus sangat spesifik untuk tujuan analisis,stabil di bawah kondisi penyimpanan normal dan menunjukkan stabilitas baik pada jumlah tes lebih besar dari 100.

2.       Reaksi tidak terpengaruh oleh pengadukan, perubahan pH dan suhu yang dapat diantisipasi lebih dahulu.

3.       Respon harus akurat, tepat, reprodusibel dan linier pada rentang analisis yang ditetapkan.

4.       Jika biosensor yang akan digunakan untuk pemantauan secara klinis,
harus tidak memiliki efek toksik atau antigen.

Fungsi untuk mendeteksi atau memonitor kondisi berbagai hal misalnya,

1.       Mengukur tingkat keasaman (pH)

2.       Kontrol polusi

3.        Mendeteksi & mengukur kadar mikroba/zat kimia berbahaya tertentu, toksik

di udara, air, dan tanah; mis.pestisida

4.       Penentuan BOD (biological oxygen demand)

5.       Penentuan parameter kualitas pada susu

6.       Mendeteksi & mengukur : kadar glukosa, kolesterol, tekanan darah, flu dll

7.       Diagnosis untuk : obat, metabolit, enzim, vitamin

8.       Penyakit infeksi, alergi.

9.       Studi efisiensi obat

Biosensor bersifat spesifik, karenabioreseptornya spesifik hanya klop/cocokuntuk suatu substansi/zat/mol yangspesifik. Komponen dasar biosensor adalah

1.       Biokatalis/bioreseptor, komponen biologis misalnya enzim, jaringan, organel, protein, sel dll.

2.       Transduser, komponen detektor, yang bekerja secara fisika kimia, elektrokimia yang mengubah sinyal yang dihasilkan dari interaksi antara analit dengan biokatalis menjadi sinyal lain yang dapat lebih mudah diukur dan dihitung.

3.       Elemen elektronik, prosesor sinyal yang menghasilkan data sinyal sesuai metode elektrokimia yang digunakan.

4.       Amperometri

Prinsip kerjanya adalah mengukur besarnya arus yang dihasilkan dari reaksi elektrokimia melibatkan analit, sehingga arus yang timbul sebanding dengan konsentrasi analit, sehingga perubahan analit yang kecil dapat terdeteksi.

Aplikasi penting dari amperometri adalahdalam konstruksi sensor kimia. Salah satu

sensor amperometri pertama yangdikembangkan adalah untuk pengukuranoksigen terlarut dalam darah yangdikembangkan pada tahun 1956 oleh LC.Clark.

                Elektrode oksigen mendeteksi konsentrasi oksigen terlarut dalam analit dari proses reduksi pada katoda Pt. Perbedaan tegangan antara katoda dan anoda pada tegangan input 600mV, sehingga menyebabkan oksigen yang berada pada sistem akan tereduksi. kuantitas oksigen yang tereduksi bergantung pada difusi  analit pada membran. Arus listrik yang terjadi pada elektroda adalah sebanding dengan konsentrasi oksigen dalam analit.

Gambar 5. Penampang elektroda amperometri tipe Clark

C.      Bahan dan Metode Kerja

Enzim glukosa oksidase bersifat terjebak (teramobilisasi) pada perrmukaan dalam dari kulit tomat segar. Enzim – membrane  diposisikan pada permukaan dari sensor oksigen terlarut. Proses deteksi didasarkan pada reaksi enzimatik glukosa yang menginduksi pengurangan oksigen terlarut dalam larutan. Penurunan tingkat oksigen terlarut teramati sebanding dengan kadar glukosa dalam sampel.

               

                Preparasi membran kulit tomat:

1.       Kulit tomat segardikupas dengan hati-hati dan isinya dibuang.

2.       Cuci kulit tomat dengan air deionisasi.

3.       100 µL larutan 5 mg/ml enzim glukosa oksidase, disuntikkan ke atas permukaan kulit tomat dan biarkan mengering.

4.       50 µL larutan glutaraldehide 5% sebagai reagen ikatan silang diteteskan sedikit demi sedikit ke membrane.

5.       Setelah 2 jam, cuci membrane dalam buffer fosfat (0.20 mol/L, pH 6.5) untuk menghilangkan kelebihan glutaraldehide.

6.       Setelah proses pencucian, simpan membrane pada suhu 4^oC dan terlindung dari cahaya.

Sifat membran kulit tomat :

1.       Kulit tomat yang berpori memungkinkan difusi cepat dari molekul kecil seperti O_2.

2.       Tidak ada persyaratan khusus yang diperlukanuntuk kulit tomat. Semua jenis tomat dapat digunakan.

3.       Kulit tomat bersifat mudah sobek sehingga penempatannya pada elektroda dilakukan dengan perlahan.

4.       Ketebalan kulit tomat yang diharapkan 100 – 500 µm.

5.       Aktivitas enzim yang terjebak pada kulit tomat stabil pada suhu 4^oC.

Prosedur Kerja :

1.       Glukosa oksidase – membrane kulit tomat ditempatkan diatas permukaan elektroda oksigen Pasco CI-6542 (Pasco Scientific) dan elektroda diposisikan tetap dengan menggunakan cincin penyangga.

2.       Elektroda enzim di rendam  dalam 5 mL  buffer fosfat 0.20 mol/L pH 6.5 sambil di aduk.

3.       Konsentrasi glukosa yang terukur didasarkan pada perubahan oksigen terlarut dalam buffer.

4.       Studi ini terdiri atas 300 relawan  dalam keadaan puasa pagi (8 jam), yang sedang melakukan rawat jalan di klinik Rumah Sakit Chengdu Pertama Rakyat (Chengdu, Sichuan, PR China).

5.       Sample darah disentrifuge dengan kecepatan 1252 selama 4 menit untuk memisahkan serum.

6.       1 mL supernatan ditambahkan dengan 4 mL buffer fosfat 0.20mol/L pH 6.5.

7.       1 mL campuran larutan (6) di injeksikan kedalam 5 mL larutan buffer dimana terdapat elektroda enzim.

D.      Hasil dan Pembahasan

Evaluasi linearitas dari biosensor, beberapa konsentrasi glukosa berbeda disiapkan untuk pembuatan kurva standar.Respon yang terukur dari biosensor untuk level glukosa 10 – 30 mmol/L menunjukkan hubungan linear Y = aX + b  à DO = 0.188*(glucose) – 0.0331, dengan r² = 0.9986. LOD 0.20 mmol/L.

Gambar 6. Kurva linier regresi untuk biosensor 1,0-30,0 mM glukosa dan Respon khas dari biosensor  pada serum dengan adisi glukosa pada  konsentrasi  (1) 3,07, (2) 4,61, dan (3) 7.63mM. 

Berdasarkan membran glukosa oksidase kulit tomat, metode baru sistem kontrol glukosa darah dirancang.Biosensor dirancang untuk pengukuran cepat glukosa darah 6 sampai 8 detik dengan konsentrasi dalam rentang yang lebih luas 1 – 30 mmol/L.Glukosa dalam sampel darah yang terukur berada pada rentang 3.07 – 29.31 mmol/L, sehingga dapat disimpulkan penelitian ini cukup untuk merepresentasikan pasien diabetes dalam populasi yang lebih besar.

Gambar 7. Perbandingan tingkat  kesalahan dari pengukuran glukosa dengan biosensor kulit tomat dan Hitachi Analyser Glucose

Dari gambar 7 menjelaskan bahwa tingkat  kesalahan analisis dari dua metode yaitu biosensor kulit tomat dan Hitachi Analyser Glucose  pada sampel darah jenis serum terdapat beberapa zona kesalahan.

a.         Zona  A, hasil pengukuran  akurat; 

b.         Zona B, menyimpang dari metode referensi sebesar 20% tetapiakan menyebabkan kesalahan pengobatan ringan; 

c.          Zona C, menyimpang darimetode referensi sebesar 20% dan akan mengakibatkan kesalahan pengobatan ringan; 

d.         Zona D, berpotensi berbahaya dan menyebabkankegagalan untuk mendeteksi dan mengobati konsentrasi glukosa darah diluar jangkauantarget yang diinginkan; 

e.         Zona E, akan mengakibatkan pengobatan yang keliru.

Pengujian stabilitas biosensor telah dilakukan dengan menambahkan 8 mmol/L larutan glukosa ke dalam larutan buffer. Signal sangat stabil sebelum dan sesudah injeksi glukosa 8 mmol/L selama 83 menit. Stabilitass biosensor akan dievaluasi setiap 6 bulan. Tingkat presisi pada beberapa variasi konsentrasi glukosa menunjukkan hasil yang baik dengan RSD <2%.

Glukosa oksidase biosensor dapat diaplikasikan untuk menentukan konsentrasi glukosa dalam serum manusia, yang memiliki keuntungan  kemudahan dalam tahap preparasi, waktu respon yang cepat, murah, dan sensitivitas yang tinggi. 

               

Daftar Pustaka :

1.       Aziz, Dr. Azila Abdul., Production of Enzymatic Glucose Biosensor. 2006. Pusat Pengurusan Penyelidikan. Universiti Teknologi Malaysia.

2.       Aziz, Dr. Azila Abdul., Optimizing of The Enzyme immobilizion for Amperometric Glucose Biosensor. 2006. Pusat Pengurusan Penyelidikan. Universiti Teknologi Malaysia

3.       David Falk., Amperometric Oxygen Electrode.1997. Bioanalytical System West Lafayyete

4.       Ekosari., Biosensor untuk Bioteknologi. 2010

5.       Ghous, T., Analytical Application of Immobilised Enzyme. 2001. Kotli Kashmir

6.       Han H, Li Y, Zhou Z., Clinical Determination of Glucose In Human Serum by Tomato Skin Biosensor, 2008. Clinica Chimica Acta

7.       Wang Y, Xu H., Electrochemical Sensor for Clinical Analysis, 2008. Sensor Journal